Дэвид Ливингстон первым из европейцев вышел на берег озера Ньяса
Путешествовать вверх по Замбези на пароходе оказалось невозможным, препятствием стали пороги Кебрабасса, не замеченные Ливингстоном во время его первого путешествия. Вместо исследования верхнего течения Замбези Ливингстон решил подняться по её северному притоку Шире. Местные жители рассказали, что Шире вытекает из огромного озера, которое даже на быстрой лодке можно пересечь лишь за полтора дня. На Шире экспедиции снова воспрепятствовали водопады, которые Ливингстон назвал в честь президента Географического общества Мерчисона, опередившего миссионера в разграничении бассейнов Конго и Замбези. 18 апреля 1859 года Ливингстон добрался до бессточного озера Ширва. Это было не то озеро, о котором говорили туземцы, но за неимением провизии экспедиция должна была вернуться назад. Через четыре месяца Ливингстон снова отправился к верховьям Шире, и 17 сентября 1859 года, перейдя покрытое лесом плоскогорье, экспедиция достигла южного края окруженного горами озера Ньяса.
В сентябре 1861 года Ливингстон снова посетил берега Ньясы. Он двинулся на север по её западному берегу, тогда как его брат Чарльз следовал вдоль побережья на лодке. Далеко на север им продвинуться не удалось из-за недоверия местных жителей и штормов, возникших на озере. Ливингстон составил первую более-менее достоверную карту озера — узкого водоёма, растянутого по меридиану, по мнению исследователя, более чем на 400 км. Приозёрные регионы Ливингстон признал перспективными для колонизации, кроме того, он считал необходимым установить контроль над озером, через которое происходил вывоз рабов из внутренних районов Африки в мусульманские торговые города на океанском побережье, для прекращения региональной работорговли.
Для учреждения миссионерских поселений на берегах озера британское правительство подготовило два парохода — «Пионер» и «Леди Ньяса». На этих судах Ливингстон в марте 1861 года, а потом в сентябре 1862 года исследовал речку Рувума, впадающую в Индийский океан на севере Мозамбика, пытаясь найти окольный маршрут к Ньясе, который бы не пересекал территории под португальским контролем. Во время второй экспедиции Ливингстон продвинулся вверх по Рувуме на 250 км, но дальше путь снова преградили пороги. Только позже было доказано, что Рувума не соединяется с озером, и этим путём добраться до него по воде невозможно.
К неудачам экспедиции прибавились семейные трагедии. Вначале Ливингстон потерял сопровождавшую его жену, а затем — старшего сына Роберта. Мэри Ливингстон умерла от малярии 27 апреля 1862 года в Шупанге на Замбези. Старший сын Ливингстона Роберт, который должен был присоединиться к экспедиции отца в 1863 году, вместо этого поехал в охваченные гражданской войной Соединенные Штаты Америки, где записался добровольцем в армию Севера, чтобы сражаться против рабовладельцев. Он был ранен под Лорел-Хиллом в Виргинии, попал в плен и умер в лагере для военнопленных под Солсбери, Северная Каролина, 5 декабря 1864 года, когда его отец уже возвратился из Африки в Британию. К тому же брат исследователя Чарльз ещё в ходе экспедиции заболел дизентерией и был вынужден вернуться в Англию.
В 1863 году экспедиция снова возвратилась к западному берегу Ньясы. На этот раз Ливингстон отправился вглубь страны. Он выяснил, что горы, которые окружают озеро, на самом деле представляют собой широкие плоскогорья, отделяющие Ньясу от низменной области на востоке, насыщенной реками и озёрами. Некоторые реки текли на север. Именно проверке гипотезы, что они являются настоящими истоками Нила, была в определённой степени посвящена следующая экспедиция Ливингстона в Африке.